정윤서는 과거 설지윤이라는 이름으로도 활동했다. 영화와 드라마를 오가며 엄마, 사모님, 비서, 간호사, 교사, 연쇄살인마 등 다양한 생활 밀착형 캐릭터 또는 범죄와 정신적 깊이있는 캐릭터를 연기해온 배우다. 1993년 뮤지컬 《올리버》를 통해 데뷔했다는 자료가 있으며, 이후 영화와 방송으로 활동 영역을 넓혔다. 영화에서는 《주홍글씨》에서 마담, 《혈의 누》에서 ​강 수사의 아내, 《태풍》에서 ​신의 친척, 《조용한 세상》에서 ​양식집 마담, 《우리 동네》에서 ​효이 엄마, 《작전》에서 ​가정주부, 《나쁜 피》에서 ​엄마, 《오직 그대만》에서 ​재활원 원장, 《이웃사람》에서 ​라디오 뉴스 앵커 목소리, 《관능의 법칙》에서 ​카페 여주인, 《데자뷰》에서 ​우진 엄마, 《임을 위한 행진곡》에서 ​태자, 《개 같은 것들》에서 ​수진, 《내안의 그놈》에서 ​담당 주치의, 《감동주의보》에서 ​떡집 여자, 《화사한 그녀》에서 ​보석가게 주인 등을 맡았다. 드라마에서도 꾸준히 활동했다. 《야인시대》, 《얼음꽃》, 《죽도록 사랑해》, 《서동요》, 《맨발의 사랑》, 《환상의 커플》, 《왕과 나》, 《대왕세종》, 《우리집에 왜왔니》, 《찬란한 유산》, 《멈출 수 없어》, 《두 아내》, 《솔약국집 아들들》, 《상류사회》, 《발칙하게 고고》, 《몬스터》, 《나쁜형사》, 《번외수사》, 《운수 오진 날》 등에 출연했다. 최근 작품으로는 2021년 《쇼윈도: 여왕의 집》, 2024년 MBN 《세자가 사라졌다》에서 조상궁, KBS2 《신데렐라 게임》에서 ​장비서 역으로 출연했다. 특히 《신데렐라 게임》에서는 비서 캐릭터를 맡아 극의 주요 인물들과 함께 호흡을 맞췄다. 정윤서는 주연보다는 작품 속에서 현실적인 주변 인물을 맡아 극의 완성도를 높여온 배우다. 영화와 드라마를 합쳐 오랜 기간 꾸준히 활동했으며, 장르와 캐릭터에 따라 엄마부터 사모님, 비서, 의료진, 뉴스 앵커 등 폭넓은 역할을 소화해왔다. 2025년 영동선에 출연했다. 2024년 신데렐라 게임에서 비서장 역을 맡았다. 2021년 수상한 법정에서 Ji-yoon 역을 맡았다.