윤진서는 2001년 영화 '버스, 정류장'으로 연기활동을 시작한 배우다. 초기에는 단역과 단편영화 출연이 주였지만, 2003년 박찬욱 감독의 영화 '올드보이'에 조연으로 출연하면서 신비하고 순수한 이미지의 캐릭터 '이수아'로 대중의 주목을 받았다. 이 역할로 2004년 백상예술대상 영화부문 여자 신인연기상을 수상하며 배우로서의 위상을 정립했다. 그 이후 '슈퍼스타 감사용', '내 생애 가장 아름다운 일주일', '바람 피기 좋은 날', '비스티 보이즈', '비밀애' 등 공포, 코미디, 멜로 등 다양한 장르의 영화에 출연하며 활동을 이어가고 있다. 은은하면서 관능적인 표정 연기로 알려져 있으며, 배우 활동 외에도 2013년 산문집 '비브르 사 비'와 2015년 소설 '파리 빌라'를 저술하는 등 다방면에서 창작활동을 펼치고 있다. 2007년 제8회 서울영화제 홍보대사를 역임하기도 했다. 올드보이 이후 그 정도의 큰 화제작에는 출연하지 않았지만, 표정 연기를 특기로 하는 배우로서 꾸준히 활동해오고 있다. 2024년 둘, 다시 하나에 출연했다. 2022년 모범가족에서 강은주 역을 맡았다. 2019년 재혼의 기술에서 Mi-Kyung 역을 맡았다.